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倒置熒光顯微鏡使用常見問題和解決

倒置熒光顯微鏡是細胞培養、細胞轉染和很多生物研究中常用的儀器，相比共聚焦顯微鏡，倒置熒光顯微鏡的成像精度雖然稍低，但儀器更普及，更容易買到或者約到，而且使用維護都更簡單點。今天我們就給大家分享下倒置熒光顯微鏡使(shi)用可能遇到(dao)的常(chang)見(jian)問題，以及可能的解決辦(ban)法。

·什么是倒置熒光顯微鏡

倒置(zhi)熒光(guang)顯微(wei)鏡MF52-CF

倒置熒光顯微鏡由倒置顯微鏡和落射熒光模塊組成，倒置顯微鏡是相對正置顯微鏡的概念，其物鏡、照明系統相對樣品的位置是顛倒的；落射熒光模塊是(shi)熒(ying)光觀(guan)察的核心部件(jian)，有(you)轉(zhuan)盤(pan)式熒(ying)光模(mo)塊和(he)集成熒(ying)光模(mo)塊兩(liang)種，轉(zhuan)盤(pan)式后期可升級，但(dan)需要(yao)獨立的熒(ying)光光源(yuan)燈箱，用轉(zhuan)盤(pan)式模(mo)塊的倒置熒(ying)光顯(xian)微(wei)鏡更(geng)大、更(geng)重、更(geng)貴(gui)。

·為什么要用倒置熒光顯微鏡

倒置熒光顯微鏡通常最(zui)高只會配(pei)40X物鏡，因此放大倍(bei)率、分辨率不如正置熒光顯微鏡，但(dan)勝在(zai)應(ying)用層面(mian)更方便好用。

倒置熒光顯微鏡(jing)觀察多(duo)孔板

首先倒置熒光顯微鏡的物鏡(jing)有(you)更(geng)(geng)長工具距離(li)，可(ke)以(yi)適(shi)(shi)配各(ge)種培養(yang)皿從(cong)底部直(zhi)接成像，從(cong)而節省了反復制(zhi)樣做(zuo)玻(bo)片的麻煩，效率更(geng)(geng)高更(geng)(geng)適(shi)(shi)合(he)大批(pi)量、多(duo)視野培養(yang)細胞(bao)等樣品的觀察。

倒置(zhi)熒光顯微鏡觀察(cha)無(wu)沾染觀察(cha)

另一點優勢是倒置熒光顯微鏡可以無沾(zhan)(zhan)染觀(guan)(guan)察，無沾(zhan)(zhan)染意思是因為觀(guan)(guan)察無需打開(kai)培養皿，可避免取樣(yang)(yang)制樣(yang)(yang)帶來的沾(zhan)(zhan)染污染風(feng)險。

倒(dao)置熒(ying)光顯微MF53-N搭配顯微操作系統

最后一個倒置熒光顯微鏡的(de)優(you)勢是(shi)更大的(de)工(gong)作空間，因為倒置熒光(guang)顯微的(de)明(ming)場照明(ming)系(xi)統(tong)采(cai)用(yong)(yong)的(de)是(shi)長工(gong)作距離聚光(guang)鏡，因此載(zai)物(wu)臺(tai)上方有更大空間，更方便安裝使(shi)用(yong)(yong)顯微操作系(xi)統(tong)等配(pei)件。

·怎么使用倒置熒光顯微鏡

倒置熒(ying)光顯微鏡(jing)相(xiang)襯和(he)熒(ying)光疊加成像

倒置熒光顯微鏡通常可以(yi)(yi)(yi)實(shi)現明(ming)場、相(xiang)(xiang)襯(chen)和熒(ying)光(guang)(guang)(guang)(guang)(guang)觀(guan)(guan)察(cha)，如(ru)果儀器附近有貼SOP或者說(shuo)明(ming)書，可以(yi)(yi)(yi)看(kan)(kan)(kan)看(kan)(kan)(kan)，快速上手。明(ming)場觀(guan)(guan)察(cha)很簡(jian)單，可以(yi)(yi)(yi)看(kan)(kan)(kan)病理切片(pian)等(deng)樣(yang)品，這里不贅(zhui)述；相(xiang)(xiang)襯(chen)觀(guan)(guan)察(cha)需要切換到相(xiang)(xiang)襯(chen)物鏡(jing)，然后把上光(guang)(guang)(guang)(guang)(guang)源光(guang)(guang)(guang)(guang)(guang)強調高，聚(ju)光(guang)(guang)(guang)(guang)(guang)鏡(jing)光(guang)(guang)(guang)(guang)(guang)闌調到PHP位(wei)置(zhi)（最大位(wei)置(zhi)），切換相(xiang)(xiang)襯(chen)環板到對應的位(wei)置(zhi)即可；難(nan)點(dian)是熒(ying)光(guang)(guang)(guang)(guang)(guang)觀(guan)(guan)察(cha)，不同倒(dao)(dao)置(zhi)熒(ying)光(guang)(guang)(guang)(guang)(guang)顯(xian)微(wei)鏡(jing)有不同結構，大致可以(yi)(yi)(yi)分為研究級倒(dao)(dao)置(zhi)熒(ying)光(guang)(guang)(guang)(guang)(guang)顯(xian)微(wei)鏡(jing)和新型(xing)倒(dao)(dao)置(zhi)熒(ying)光(guang)(guang)(guang)(guang)(guang)顯(xian)微(wei)鏡(jing)兩種，我們(men)分別以(yi)(yi)(yi)MF53-N和MF52-N為例(li)進行說(shuo)明(ming)。

研究級倒置熒光顯微鏡MF53-N

MF53-N是研究級倒置熒光顯微鏡的代表，它采用轉盤式熒光模塊，可以(yi)(yi)按需(xu)選擇不同(tong)的(de)熒(ying)(ying)光(guang)(guang)激發塊，背(bei)面帶熒(ying)(ying)光(guang)(guang)燈(deng)箱(xiang)接口，可以(yi)(yi)使(shi)用(yong)大(da)功(gong)率寬光(guang)(guang)譜LED熒(ying)(ying)光(guang)(guang)光(guang)(guang)源MG-100、四通(tong)道光(guang)(guang)源MG-120或者汞燈(deng)等作為熒(ying)(ying)光(guang)(guang)光(guang)(guang)源。

這種倒(dao)置熒(ying)光(guang)(guang)顯微(wei)鏡(jing)會有獨立的光(guang)(guang)源控(kong)(kong)制器(qi)(qi)，首先關閉明場光(guang)(guang)源，通過(guo)控(kong)(kong)制器(qi)(qi)打開(kai)熒(ying)光(guang)(guang)光(guang)(guang)源，調節(jie)光(guang)(guang)強，然(ran)后轉盤選擇熒(ying)光(guang)(guang)通道，放(fang)樣品，操作對焦，再切(qie)換分光(guang)(guang)拉桿到相機成像拍照。不同熒(ying)光(guang)(guang)通道需(xu)要(yao)分別調節(jie)光(guang)(guang)強并(bing)拍照，如果是MG-100或者(zhe)MG-120，光(guang)(guang)源可以即開(kai)即用，亮度可自由調節(jie)，比較方(fang)便，而汞燈使用需(xu)要(yao)預(yu)熱、亮度只能靠ND減光(guang)(guang)鏡(jing)控(kong)(kong)制，操作更(geng)(geng)復(fu)雜，也更(geng)(geng)容(rong)易出各種問題。

倒(dao)置(zhi)熒(ying)光顯微鏡MF52-N

MF52-N是新型倒置熒光顯微鏡的代表，它采用高度集成的數顯LED熒光模塊，不需要外接(jie)熒(ying)(ying)光(guang)燈箱和(he)控制(zhi)器，能直接(jie)在模塊上控制(zhi)熒(ying)(ying)光(guang)開關、光(guang)強設置和(he)通道切換等(deng)操作，并提供數據化光(guang)強顯示(shi)，可以配備(bei)3個熒(ying)(ying)光(guang)通道，滿足BGU等(deng)常見的(de)熒(ying)(ying)光(guang)觀(guan)察需要，更易于使(shi)用(yong)。

新型倒置(zhi)熒光(guang)顯微(wei)鏡(jing)結構比研究(jiu)級簡(jian)單，首先關閉明場光(guang)源，打開(kai)模塊(kuai)上的光(guang)源開(kai)關，然后拉桿(gan)切換熒光(guang)通道并調節光(guang)強(qiang)，放樣品，后續操作(zuo)和研究(jiu)級一樣就行(xing)。奧(ao)林巴斯CKX41、CKX53都(dou)可(ke)以(yi)通過明美的倒置(zhi)熒光(guang)模塊(kuai)升級成(cheng)類似的新型倒置(zhi)熒光(guang)顯微(wei)鏡(jing)。

升級熒光觀察的DMIL

另外，尼康TS100、徠卡DMIL這兩款無限遠光學倒置，也能通過我們的熒光模塊和熒光光源升級成倒置熒光顯微鏡，但(dan)它們都是外(wai)掛(gua)熒(ying)(ying)光(guang)(guang)光(guang)(guang)源搭配推拉(la)切換(huan)熒(ying)(ying)光(guang)(guang)通道的(de)設計，用(yong)起來比一般的(de)新型倒置熒(ying)(ying)光(guang)(guang)顯微鏡復雜些。

·怎么拍出好的熒光圖片？

高靈(ling)敏度相機成像更好

這是很多實驗操作人員非常關心的問題，首先要說明的一點是，倒置熒光顯微鏡的光路結構比正置熒光顯微鏡復(fu)雜(za)，光損更(geng)大，因此(ci)熒(ying)光拍照難度比正置高，需(xu)要比較高靈敏度的相機，比如(ru)MSX11、MC50-S等，尤其一些采(cai)用了固定(ding)分光設計的倒置熒(ying)光顯微(wei)鏡。

半復(fu)消色差物(wu)鏡效果更(geng)好

第二個點(dian)是選(xuan)擇合適的(de)(de)(de)物鏡(jing)(jing)(jing)，落射(she)熒(ying)光(guang)觀察中激發光(guang)和(he)發射(she)光(guang)都需要經過物鏡(jing)(jing)(jing)一(yi)(yi)趟，物鏡(jing)(jing)(jing)熒(ying)光(guang)通(tong)過率低的(de)(de)(de)話會導致光(guang)損(sun)非常(chang)大(da)，一(yi)(yi)般的(de)(de)(de)相襯物鏡(jing)(jing)(jing)、帶厚度適配環的(de)(de)(de)物鏡(jing)(jing)(jing)都有較大(da)光(guang)損(sun)，可以的(de)(de)(de)話應該選(xuan)擇半(ban)復消色差(cha)的(de)(de)(de)相襯物鏡(jing)(jing)(jing)/普通(tong)物鏡(jing)(jing)(jing)，它們上面會有SAPO（Semi-APO）、PL FL、Fluor之(zhi)類標記(ji)，如(ru)果有APO標記(ji)的(de)(de)(de)復消色差(cha)的(de)(de)(de)物鏡(jing)(jing)(jing)更好，如(ru)果沒有半(ban)復消色差(cha)用Plan標記(ji)的(de)(de)(de)平場消色差(cha)的(de)(de)(de)物鏡(jing)(jing)(jing)也還能湊合。

多色熒光需(xu)要分別(bie)微調對焦(jiao)

第三(san)個點是對(dui)焦(jiao)(jiao)，不同(tong)熒(ying)光通道(dao)的(de)(de)波長不同(tong)，焦(jiao)(jiao)面會有一定(ding)的(de)(de)偏移，因(yin)此不同(tong)熒(ying)光通道(dao)需要分別(bie)微調對(dui)焦(jiao)(jiao)才能獲得更銳利的(de)(de)成像，明美顯微數碼測(ce)量(liang)分析系(xi)統(tong)軟件界面下(xia)方的(de)(de)清晰度狀態(tai)數據可以為對(dui)焦(jiao)(jiao)提供參考(kao)。如果您是半復消(xiao)色差的(de)(de)相(xiang)(xiang)襯物鏡，還能先在相(xiang)(xiang)襯下(xia)對(dui)好焦(jiao)(jiao)，再切換到熒(ying)光拍照，減少淬滅的(de)(de)可能性(xing)。

·可能遇到哪些常見問題？

倒置熒光顯微鏡結構比共聚焦簡(jian)單(dan)，出問題的機率更(geng)低，但(dan)并不(bu)是不(bu)會(hui)出問題，好消(xiao)息是很(hen)多問題可能簡(jian)單(dan)處理一下也能排除。

熒光(guang)模塊沒轉到位會擋住(zhu)激(ji)發光(guang)

常見問題1：沒(mei)有激發光(guang)(guang)(guang)。從光(guang)(guang)(guang)源開始(shi)檢查光(guang)(guang)(guang)路(lu)，光(guang)(guang)(guang)源接好并打(da)開了(le)嗎？熒(ying)光(guang)(guang)(guang)切換機構是否旋(xuan)轉(zhuan)到位/拉桿切換到位了(le)？是否有錯位的ND濾鏡？是否Shutter關上了(le)？如果整個(ge)光(guang)(guang)(guang)路(lu)都正(zheng)常，可能(neng)就是光(guang)(guang)(guang)源壞(huai)了(le)，對于汞(gong)燈(deng)就是換燈(deng)泡，LED熒(ying)光(guang)(guang)(guang)光(guang)(guang)(guang)源可能(neng)換個(ge)通道還(huan)能(neng)用，因為不(bu)(bu)同熒(ying)光(guang)(guang)(guang)通道對應的是不(bu)(bu)同的LED燈(deng)珠/燈(deng)珠陣(zhen)列。

分光拉桿沒(mei)拉到位會沒(mei)有成像

常(chang)見問(wen)題(ti)2：有(you)激發光(guang)(guang)(guang)但沒(mei)成像。先觀察分光(guang)(guang)(guang)欄桿，分光(guang)(guang)(guang)欄桿沒(mei)到位的(de)(de)話(hua)目(mu)(mu)鏡(jing)(jing)(jing)和相(xiang)(xiang)機(ji)(ji)都會沒(mei)有(you)成像，目(mu)(mu)鏡(jing)(jing)(jing)通常(chang)很(hen)好確認有(you)無熒光(guang)(guang)(guang)，除非是(shi)CY5之(zhi)類(lei)肉(rou)眼看不見的(de)(de)近紅(hong)外波長。目(mu)(mu)鏡(jing)(jing)(jing)有(you)成像，相(xiang)(xiang)機(ji)(ji)看不到就(jiu)要調整曝光(guang)(guang)(guang)時(shi)間和曝光(guang)(guang)(guang)增益，如(ru)果(guo)近期升級(ji)過(guo)系統(tong)可能還有(you)驅動失效之(zhi)類(lei)問(wen)題(ti)。如(ru)果(guo)最(zui)終成像細節(jie)較差、容易過(guo)曝，基(ji)本就(jiu)是(shi)相(xiang)(xiang)機(ji)(ji)靈敏(min)度太低的(de)(de)問(wen)題(ti)，除了升級(ji)相(xiang)(xiang)機(ji)(ji)沒(mei)有(you)什么好方(fang)法解決。

亂動燈箱上的旋鈕會導致熒光不均勻

常見問題(ti)3：有(you)(you)成像(xiang)但有(you)(you)異常瑕疵，就要(yao)看(kan)情況。比如(ru)熒(ying)光(guang)(guang)(guang)不均勻，可能(neng)(neng)是熒(ying)光(guang)(guang)(guang)燈箱(xiang)調錯了(le)聚(ju)(ju)光(guang)(guang)(guang)位置；有(you)(you)強熒(ying)光(guang)(guang)(guang)背景，可能(neng)(neng)是上聚(ju)(ju)光(guang)(guang)(guang)鏡反(fan)光(guang)(guang)(guang)了(le)，上聚(ju)(ju)光(guang)(guang)(guang)鏡有(you)(you)擋板(ban)的(de)用(yong)(yong)擋板(ban)，無擋板(ban)的(de)收小光(guang)(guang)(guang)闌也(ye)可能(neng)(neng)有(you)(you)用(yong)(yong)；FITC和TRITC重疊、有(you)(you)信號(hao)但預期(qi)目標沒染出來(lai)，可能(neng)(neng)不是儀器問題(ti)，是出現(xian)了(le)交叉反(fan)應，需要(yao)重新檢查染色流程是不是做錯了(le)。

·倒置熒光顯微鏡能不能用高倍油浸物鏡？

一般來說倒(dao)(dao)置熒光顯微(wei)鏡(jing)配備的(de)(de)物(wu)(wu)鏡(jing)最高只有40X，因(yin)(yin)為倒(dao)(dao)置熒光顯微(wei)鏡(jing)的(de)(de)上聚(ju)光鏡(jing)NA數(shu)值孔徑(jing)不(bu)到0.6，無法匹配60X/100X等高數(shu)值孔徑(jing)物(wu)(wu)鏡(jing)。但如果(guo)只看熒光觀察的(de)(de)話，其(qi)實倒(dao)(dao)置熒光顯微(wei)鏡(jing)是可以(yi)搭配100X油(you)浸物(wu)(wu)鏡(jing)使用的(de)(de)，需要(yao)注意的(de)(de)是，100X物(wu)(wu)鏡(jing)是為0.17厚(hou)度的(de)(de)蓋玻片校正的(de)(de)，因(yin)(yin)此(ci)需要(yao)使用0.17厚(hou)度的(de)(de)共聚(ju)焦培養皿或者(zhe)反轉(zhuan)放置的(de)(de)細胞(bao)爬片。

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